第三代测序技术是指基于单分子测序原理的测序技术，其原理是将单个DNA分子固定在一个小孔中，通过测量DNA分子在小孔中的电信号变化来确定其序列。这种技术不需要PCR扩增和化学标记，因此可以避免PCR偏差和化学污染等问题，同时具有高通量、高准确性和长读长等优点。
第三代测序技术主要有两种方法：纳米孔测序和单分子实时测序。纳米孔测序是将单个DNA分子引导通过一个纳米孔，通过测量DNA分子在纳米孔中的电信号变化来确定其序列。单分子实时测序是将单个DNA分子固定在一个表面上，通过测量DNA分子在荧光染料的激发下发出的荧光信号来确定其序列。
第三代测序技术的原理基于单分子测序，因此可以避免PCR扩增和化学标记等步骤对测序结果的影响，同时具有高通量、高准确性和长读长等优点，是当前测序技术的发展方向之一。